晶泰科技-晶研谈 | 实验+计算高效筛选药物稳定晶型

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关于晶研谈

晶研谈是由晶泰科技发起的药物固态研究交流专栏，旨在与学术专家及业界同行就药物固体形态研究中的问题与挑战进行深入交流，分享最新研究进展，讨论前沿创新技术，探索有效解决方案，共同促进国内药物固体形态研究的发展及繁荣。

加速抗病毒药物的晶型研发

晶体结构是药物构效中必不可少的研究部分，不同晶型的采用对药物的物理化学性质乃至药品的质量与疗效有深远影响。药物研发团队需要准确、快速地判定药物不同晶型的稳定性，并选择高稳定的药用晶型，从而帮助药物早日上市、并安全地投入广泛使用。瑞德西韦 (Remdesivir) 因其广谱抗病毒潜力而受到关注，并于 2020 年 10 月率先获美国 FDA 批准上市，而其真实晶型结构在较长一段时间未曾被披露。为了探索实验+计算的晶型研发在类似场景中的应用潜力，以瑞德西韦为例，晶泰科技的药物固态研发团队同时利用晶型预测（Crystal Structure Prediction，CSP）和微晶电子衍射 (Microcrystal Electron Diffraction，MicroED），对其晶体结构进行了研究。

基于冷冻电镜的 MicroED 结构解析

传统的 X 射线单晶衍射 (Single Crystal X-ray Diffraction，SC-XRD) 是作为实验测定晶体结构的“黄金标准”，但对单晶样品的尺寸和质量有较高要求，具有一定的实现难度，且需要花费数月时间制备，不适用于疫情初期只有粉末样品的瑞德西韦。

与 SC-XRD 相比，MicroED 使用高能电子代替 X 射线来产生衍射图样，可以直接作用于亚微米尺度的粉末样品，并可获得更高分辨率的衍射数据。晶泰科技的药物固态研发团队采用更先进的 MicroED 技术，跳过单晶培养，直接使用瑞德西韦 Form II 和 Form IV 两种晶型的粉末样品，获得了原子尺度分辨率的衍射数据，并在一周内成功地解析出它们的晶体结构。

图1：使用 MicroED 技术解析瑞德西韦两种晶型样品的晶体结构的流程图。（A）在冷冻透射电镜中，将样品颗粒按照一定速度进行旋转，以获得一系列不同角度的衍射图样；（B）从样品颗粒获得的衍射图样示意图；（C）从衍射数据中重构出的电子密度分布图以及不同晶型 FormII（上）和 FormIV（下）晶胞中的瑞德西韦分子结构图（D）。

图2：使用 MicroED 技术获得的瑞德西韦两种不同晶型 FormII（左）与 FormIV（右）晶体中最小非对称单元示意图。两种晶型均为 P2（1） 空间群，并且晶胞体积大小较为接近，但是瑞德西韦分子的构象和堆叠情况差异较大。

晶型预测（CSP）确认室温下晶型的稳定性排序

与此同时，基于计算的 CSP 筛选与 MicroED 实验同步进行。传统的晶型筛选通过实验探索潜在晶型，需要充足的原料样品和实验时间。而 CSP 技术根据药物分子的复杂程度，可在 3~5 周内预测出潜在的热力学稳定晶型，并给出不同温度（0K~400K）下晶型的热力学稳定性排位，从而帮助实验专家判断实验筛选是否充分、筛选出的晶体粉末的纯度、了解晶型稳定性风险等关键问题，可显著加速研究和决策进程，有效避免固体形态在后期应用时的风险。

瑞德西韦（C27H35N6O8P)由 77 个原子组成，包括 16 个柔性角，属于较为复杂、具有一定预测挑战性的分子。晶泰科技的药物固态研发团队以其 2D 分子结构作为输入信息，在自研的晶体搜索算法中产生数以亿计的晶体结构，然后结合分子力学方法、半经验方法、密度泛函方法等对这些晶体结构进行稳定性评估，最终得到瑞德西韦晶型在 0 K 温度下的稳定性排序（下图A）。

图3：经过理论计算获得的瑞德西韦不同晶型在 0K 下的相对能量分布图（上图A）（以最稳定晶型为参照物，其中最稳定晶型（X1）对应实验 Form IV 晶型，次稳定晶型（X2）对于实验 Form II 晶型）以及不同晶型（X1-X5）在不同温度下相对X1晶型的能量变化（上图B）。

通过对比预测与实验晶型，确认 0K 下最稳定和次稳定晶型分别对应上述的 Form IV 和 Form II 晶型。科学家们进一步使用 Pseudo Super Critical Path（PSCP）方法评估这些晶型的相对稳定，结果显示，随着温度升高，Form II 晶型能量显著降低，在室温（300 K）及更高温度下，Form II 成为最稳定晶型，且自由能计算进一步表明在这一能量区间没有遗漏的稳定晶型存在。

理论预测与实验结果高度吻合

我们对 XRPD、MicroED、CSP 的结果进行交叉验证，以确定结果的合理性。对比 MicroED 解析结构与 CSP 预测结构，其 RMSD 分别只有 0.441 Å (Form II) 和 0.368 Å(Form IV)，说明结构是一致的；而实验 XRPD 图、MicroED 结构的模拟 XRPD 图、以及 CSP 结构的模拟 XRPD 图也高度吻合(图4)。这充分说明了 CSP 能得到准确的最稳定低能的结构，也说明 MicroED 解析结构的可靠性。

图4：实验 XRPD 图（黑）、MicroED 结构模拟 XRPD 图（红）与 CSP 结构模拟 XRPD 图（蓝）对比结果（A：Form IV，B：Form II），以及 MicroED 结构与理论预测三维结构对比图（C：Form IV，D：Form II）。

小结：实验+计算——晶泰科技药物固态研发新思路

本文展示了实验（MicroED）+ 计算（CSP）相结合的药物晶型研究方法，在有限时间内（33天）高效、准确地完成小分子药物不同晶型的结构测定、稳定晶型选取与风险评估工作。相较于传统的晶型实验研究，这一方法展现了明显的速度优势与更广泛的适用范围，为未来小分子药物晶型研发提供了更加高效的新途径。该研究成果已经被正式发表。[1]

晶泰科技药物固态研发的优势之一

MicroED

电子微晶衍射（MicroED）技术具有制备简单快速、实验效率高的优势。它将晶体学与 cryo-EM 相结合，只需要少量亚微米级（~300 nm）的结晶度较高的晶粒，就足以产生高分辨率的电子衍射图案，因此甚至只需要数小时，就可以解析出一个可靠的晶体结构。由于节省了培养单晶的时间，MicroED 效率远高于 XRD 技术[2, 3]。

除了小分子药物晶体[4]，MicroED 还被成功应用于解析多肽[5, 6]、蛋白质[2, 7]、金属有机框架材料（metal-organic frameworks）[8, 9]等复杂案例。高分辨率的衍射数据可以帮助我们准确了解亚原子级的精细结构，比如氢原子位点[4, 10]、氢键网络、结晶水与通道水、蛋白小分子结合位点[11, 12]等，可以用于鉴定水合物、研究赋形剂和 API 的相互作用、区分共晶和盐型、鉴定反应副产物等。如果已知样品中某一手性位点，或者与已知手性的配体形成共晶，还可以确定绝对构型。

晶泰科技拥有 Thermo Fisher Glacios 冷冻透射电镜和齐全的制样设备，搭建了自研的 MicroED 解析平台，可在数天内完成高精度的晶体结构测定。晶泰科技对近百个有机小分子药物晶体进行测试，统计结果显示成功率高达 90%。晶泰科技建立了成熟的业务流程，可有效满足药企对晶体结构测定的需求。

图5：Thermo Fisher Glacios Cryo-TEM

晶泰科技药物固态研发的优势之二

与晶型预测（CSP）结合

晶泰科技的晶型预测（CSP）作为一种成熟的计算技术，可以基于分子结构通过量子动力学计算与晶体自由能计算等核心技术，快速获得药物分子的最稳定、亚稳定晶型，并给出室温下的稳定性排位，锁定适合药用的优势晶型，并指导结晶实验与研发决策。常规小分子的药用晶型预测可在 2～3 周内完成，该平台还可用于对更复杂的分子体系——包括超过 15 个柔性角的分子，多柔性环复杂异构，不同盐型、共晶、水合物、溶剂化等进行预测。晶泰科技的 CSP 适用范围广、准确性与可靠性高、实验指导价值明确，已被越来越多地应用于临床前及临床早期的药物开发项目中。

晶泰科技通过使用 CSP 与 MicroED 两大技术的组合，可同时推进高精度理论预测与晶体粉末结构测定实验，并相互印证，从而实现固态研究的并行加速，进一步提高晶型筛选与优势晶型选择的效率，节省不必要的实验环节，并大幅降低药用晶型后续应用的风险，满足药企对晶型研究准确、快速、可靠、全面的多维度需求。

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参考文献

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2. Nannenga, B. L.; Gonen,T., The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods 2019, 16 (5), 369-379.

3. Wolff, A. M.;  Young, I. D.; Sierra, R. G.;  Brewster, A.S.;  Martynowycz, M. W.;  Nango, E.; Sugahara, M.;  Nakane, T.;  Ito, K.; Aquila, A.;  Bhowmick, A.;  Biel, J. T.; Carbajo, S.;  Cohen, A. E.;  Cortez, S.; Gonzalez, A.;  Hino, T.;  Im, D.; Koralek, J. D.;  Kubo, M.;  Lazarou, T. S.;  Nomura, T.; Owada, S.;  Samelson, A. J.;  Tanaka, T.; Tanaka, R.;  Thompson, E. M.;  van den Bedem, H.;  Woldeyes, R. A.;  Yumoto, F.; Zhao, W.;  Tono, K.;  Boutet, S.; Iwata, S.;  Gonen, T.;  Sauter, N. K.;  Fraser, J. S.; Thompson, M. C., Comparingserial X-ray crystallography and microcrystal electron diffraction (MicroED) asmethods for routine structure determination from small macromolecular crystals.IUCrJ 2020, 7 (2), 306-323.

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10. Palatinus, L.;  Brázda, P.; Boullay, P.;  Perez, O.;  Klementová, M.;  Petit, S.; Eigner, V.;  Zaarour, M.; Mintova,S., Hydrogen positions in single nanocrystals revealed by electron diffraction. Science 2017, 355 (6321), 166.

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12. Purdy, M. D.;  Shi, D.; Chrustowicz, J.;  Hattne, J.;  Gonen, T.; Yeager, M., MicroED structures of HIV-1 Gag CTD-SP1 reveal binding interactions with the maturation inhibitorbevirimat. Proceedings of the National Academy of Sciences 2018, 115(52), 13258.

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